دسته: آزمایشگاه

آزمایش فسفات

1- مقدمه:

ترکیبات فسفری نقش حیاتی در تمام گونه های حیات شناخته شده در زمین دارد. فسفرهای معدنی نقش کلیدی در ملوکولهای بیولوژیکی مانند DNA و RNA ایفا می کنند. همچنین سلول های زنده از فسفرهای معدنی برای ذخیره و انتقال انرژی سلولی از طریق تری فسفات آدنوزین ATP استفاده میکنند. نمک های فسفات کلیسیوم هم توسط حیوانات برای سفت شدن استخوان استفاده می شود. ضمناً فسفر یک عضو حیاتی برای پروتوپلاسم های سلولی و بافتهای عصبی میباشد. ماده فسفر آلی در طبیعت و در نمونه های آبی و پسآب فقط بصورت فسفات رخ می دهد که تحت شکل های اورتوفسفات، فسفات فشرده، و فسفات اورگانیک محدود قابل یافت است. فسفر ماده ای اساسی  و مغذی برای رشد ارگانیسم ها بوده که تولید اولیه (Primary Productivity) حجم زیادی از آب را محدود می­کند.

1-1 واژه شناسی:

تحلیل فسفر دو مرحله کلیدی را دربرمی گیرد:

1. تبدیل حالت فسفر موردنظر به اورتوفسفات محلول
2. تعیین اروتوفسفات محلول به روش رنگ سنجی

فسفاتی که به آزمون های رنگ سنجی، بدون هیدرولیز و هضم اوکسیداتیو اولیه نمونه پاسخ میدهید، تحت عنوان “فسفر واکنشی” شناخته می شود و مقدار آن بر حسب اورتوفسفات خواهد بود.

• روش های مختلفی برای تعیین میزان فسفر در نمونه های آبی و پسآب وجود دارد که به شرح زیر هستند:

1. روش هضم: از آنجایی که فسفر ممکن است به حالت ترکیبی از مواد اورگانیک باشد، برای تعیین میزان فسفر کل، روش هضم باید به خوبی قادر به اوکسید کردن مواد اورگانیک باشد تا ماده فسفر بصورت اورتوفسفات آزاد شود. سه روش هضم عمده وجود دارد که به ترتیب : روش پرکلریک اسید، روش نیتریک اسید-سولفوریک اسید، و روش اوکسیداسیون پرسولفات هستند.
2. روش رنگ سنجی: سه روش برای تعیین غلظت اورتوفسفات پیشنهاد می شود که انتخاب هر یک بستگی به محدوده غلظت اورتوفسفات دارد. این سه روش عبارتند از : روش وانادومولیبدو اسید، روش کلرید قلع، و روش آسکوربیک اسید که برای محدوده غلظت 0.01 تا 6   mg P/lمناسب است.

2- روش انجام آزمایش:

جهت تعیین مقدار فسفات در نمونه فاضلاب، از روش آسکوربیک اسید استفاده می شود. در این روش با استفاده از محلول های آسکوربیک اسید و ماده آرمسترانگ و نمونه های با مقدار غلظت فسفات معین، مقدار مجهول غلظت فسفات برای نمونه فاضلاب موردنظر تعیین می شود. برای این امر، از روش رگرسیون خطی و برازش خط مناسب به داده های استخراج شده استفاده می گردد که در نهایت با استفاده از معادله خط معین برای نمونه های ذکر شده، مقدار مجهول غلظ فسفات نمونه با استفاده از معادله خط تعیین شده، به دست می آید. در جدول شماره 1، وسایل و تجهیزات موردنیاز جهت انجام آزمایش مشخص شده است.

مراحل گام به گام انجام آزمایش:

1. تهیه محلول آسکوربیک اسید:

مقدار3  گرم از پودر آسکوربیک اسید را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل می کنیم. این محلول فقط به مدت یک هفته پایدار خواهد بود.

2. تهیه ماده آرمسترانگ: 122 میلی لیتر غلیظ را با 800 میلی لیتر آب مقطر رقیق کرده و در حالی که محلول هنوز داغ است، 10.5 گرم آمونیوم مولیبدات و 0.3 گرم تارتارات پتاسیم آنتیمونی اضافه می کنیم. پس از حل شدن محلول و خنک گردیدن آن، محلول را تا حجم 1 لیتر رقیق می کنیم.
3. تهیه محلول ذخیره پتاسیم فسفات با غلظت gr/lit1: مقدار 2 گرم   را به مدت 1 ساعت در دمای 103 درجه خشک کرده ، 0.915 گرم از آن برداشته و  سپس آن را تا 500ml در آب مقطر رقیق می کنیم.هر 1 میلی لیتر از این محلول، معادل 1 میلی گرم از یون پتاسیم فسفات خواهد بود.
4. تهیه محلول استاندارد پتاسیم فسفات با غلظت mg/lit1: پس از تهیه محلول ذخیره، مقدار 1 میلی لیتر از آن را در آب مقطر رقیق می کنیم تا به حجم 1 لیتر برسد.
5. تهیه محلول های با غلظت فسفات معین 0، 0.25، 0.5، 0.75، و 1(mg/lit): پس از تهیه محلول ذخیره فسفات، باید محلول استاندار فسفات نیز با غلظت بسیار کمتر نسبت به محلول ذخیره، آماده شود. جهت انجام آزمایش محلول استاندارد با غلظت یک­هزارم محلول ذخیره آماده می شود.
6. فرایند ترکیب محلول ها: پس از آماده سازی محلول استاندارد، باید نمونه های با غلظت مشخص را آمده کنیم. جهت این کار تعداد 6 شیشه ارلن 50 میلی­گرم آماده کرده و مطابق جدول شماره 2، محلول ها را به ترتیب ذکر شده، ترکیب می کنیم. پس از آماده سازی، مدت 20 دقیقه صبر می کنیم تا واکنش های لازم انجام شود. پس از واکنش، نمونه های رنگ متمایل به آبی به خود خواهند گرفت که خود نشان دهنده میزان غلظت فسفات در نمونه است. نمونه های ساخته شده در شکل شماره 1 قابل مشاهده است.

7. آماده سازی دستگاه اسپکتروفوتومتر

پس از آماده سازی نمونه ها، دستگاه اسپکتروفوتومتر را روشن کرده و طول موج مناسب ر ا برای انجام آزمایش تنظیم می کنیم. طول موج مورد استفاده در این آزمایش 880nm خواهد بود. برای این کار پس از روشن شدن دستگاه، وارد بخش single wavelength شده و از قسمت options، مقدار طول موج را روی 880 نانومتر تنظیم می کنیم( مطابق شکل شماره 2)

8. اندازه گیری غلظت نمونه ها در دستگاه اسپکتروفوتومتر

پس از تنظیم طول موج، نمونه با غلظت صفر(آب مقطر) را به اندازه 10 سی سی در داخل سل مخصوص ریخته و داخل اسپکتروفوتومتر قرار می دهیم. این نمونه، نمونه معرف و مرجع آزمایش خواهد بود. سپس گزینه Zeroرا انتخاب می کنیم تا میزان جذب معادل صفر را نمایش دهد(مطابق شکل شماره 3)

سپس هر یک از نمونه های ساخته شده با غلظت مشخص را داخل دستگاه گذاشته و مقدار جذب آنها را برداشت می کنیم. در انتها نیز محلول با غلظت مجهول را داخل اسپکتروفوتومتر قرار داده و مقدار جذب آن را نیز یادداشت می کنیم(مطابق شکل شماره 4 و 5).

داده های برداشت شده را در جدول شماره 3 به ترتیب زیر مرتب می کنیم.

نمودار مناسب برای این داده ها را بگونه ای رسم می کنیم که محور عمودی برابر با مقدار غلظت فسفات و محور افقی نشان دهنده میزان جذب نمونه باشد. سپس خط متناسب نقاط متناظر داده ها را برازش کرده و رابطه این خط را به دست می آوریم(مطابق نمودار 1).

رابطه حاصل از نمودار فوق به شرح زیر است:

با درنظرگیری مقدار جذب نمونه مجهول و رابطه فوق، مقدار غلظت فسفات در نمونه مجهول به قرار زیر است: